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比较基因组学是从进化角度分析不同物种的基因组数据，解析基因功能和疾病、表型的遗传学机制。通过同源基因编码区序列的进化比较是其中最常见的分析方法之一，如PAML等方法，都在物种序列比较分析中被广泛应用。但这些方法仅分析多个物种的单一序列和分歧位点信息。随着二代、三代测序技术的发展，众多物种的基因组测序都已完成，越来越多的物种都在种内水平有了多个样本的群体基因组数据。如果能将多物种群体水平的遗传多态和物种水平的进化相结合进行分析，将有助于解析物种（尤其是近缘种）产生过程中适应性进化和特有表型形成的机制。迄今为止，尚缺乏此类方法。 　　中国科学院北京基因组研究所陈华研究组与中国科学院昆明动物研究所合作，首次开发了能够同时分析多个物种的群体基因组数据的方法HDMKPRF。该方法以Hartl、Bustamante等的泊松随机场模型和McDonald-Kreitman检验为框架，通过多个物种的联合等位基因频谱理论构建群体遗传学模型，有效整合了微进化过程与宏观进化。与现有分析方法比较，该方法采用贝叶斯方法，很大程度提高了对自然选择基因的检测功效；通过多个物种的群体基因组比较分析，能够有效把自然选择发生时间定位在多物种进化树的具体某个阶段（分支）上。该方法还提供了对各个物种的群体大小、物种分化时间以及自然选择强度等参数的后验概率分布。 　　利用该方法，研究人员对现代人、黑猩猩、大猩猩和猩猩四个灵长类物种基因组数据做了分析，在各个物种中鉴定了受到自然选择而快速进化的基因。发现在人的特异性进化中，有84个与表达调控相关的基因受到正选择，广泛分布在锌指蛋白基因家族、小RNA调节通路、TP调控、组蛋白修饰基因等不同类型中，印证了进化学家Allan Wilson和Mary-Claire King在1975年提出的观点，即基因调控是人与黑猩猩在99%基因组序列相似基础上表型高度差异的主要因素之一；发现与免疫、代谢等相关的通路受到了正选择。此外，有大量的现代人与其他大猿分歧的基因富集在精神分裂症、神经系统疾病相关的通路上，部分快速进化基因集中在精子生成、生殖相关通路上。该分析提供了灵长类四类大猿基因进化在时间轴和基因组上的自然选择图谱，为后续的进一步功能解析研究提供了基础。 　　该研究于3月6日在线发表在进化生物学期刊《分子生物学与进化》上。研究得到国家自然科学基金委重大研究计划“微进化过程的多基因作用机制”、中科院先导专项“动物复杂性状的进化解析与调控”、中科院“百人计划”等的支持。 HDMKPRF方法的模型和参数示意图 应用电脑仿真对HDMKPRF在检测功效、分歧时间、选择强度等参数推断上进行性能检验

Hello，大家好，今天给大家介绍基因组测序中的比较基因组学的应用范围，干货满满哦！ 1.寻找基因/基因簇的来源与进化历程，发现基因的功能适应性以及新的基因簇的结构组成。 2.寻找与表型相关的基因或突变位点，例如耐药性基因。 3.物种进化树、基因进化树分析，判断物种的起源以及物种鉴定等。 4.泛基因组分析，共有基因、特有基因分析，找到基因组独有功能表型所对应的基因。 5.共线性分析，寻找基因组大片段变异。 6.特定类型的基因类群或家族分析。 研究文献示例 1 Diversity and distribution of the bmp gene cluster and its Polybrominated products in the genus Pseudoalteromonas    DOI:10.1111/1462-2920.14532 主要结果：比较基因组学揭示了101个Pseudoalteromonas基因组中分布在19个基因组中的4个不同的基因簇结构。这些主要定位于包含Pseudoalteromonasluteoviolacea和Pseudoalteromonasphenolica型菌株的最不具包容性的进化枝，在某些谱系中显示出明显的基因和基因簇丢失证据。Bmp基因系统发育与Pseudoalteromonas物种系统发育基本一致，表明该属内的垂直遗传。 Fig.The bmp genecluster and its products.  Fig.Pseudoalteromonas speciesphylogeny and bmp gene cluster distribution. 2. Phylogenetically informative mutations in genes implicated in antibiotic resistance in Mycobacterium tuberculosis complex DOI:10.1186/s13073-020-00726-5 主要结果：为了解结核分枝杆菌复合物（Mycobacteriumtuberculosis complex，MTBC）中与抗生素耐药相关的基因的遗传变异的关系。该作者对405个MTBC菌株进行了21种抗结核药物耐药性的92个基因的SNP检测，如下图所示分为了7个进化分支，确定基因型与表型之间的关系。 MTBCphylogeny. ML phylogeny based on 42,760 SNPs from 405 genomes using ageneral time-reversible substitution model and 1000 resamples. Sevenmajor MTBC lineages and animal-adapted species are highlighted. Wherewarranted, these were differentiated further into subgroups (as shownon the circumference of the figure). Red dots indicate branches(n =...

第一部分：色谱篇 液相色谱 1.流动相制备 跑样前先准备新鲜配置的流动相。 2.开机 打开仪器各板块电源，然后再打开工作站软件。 3.流动相填充系统 接上色谱柱，用流动相充分填充系统。如果流动相有包含缓冲盐类的，先不接色谱柱用水冲洗，再用流动相冲洗。 4. 平衡系统 调用运行方法，使用5-10倍柱体积的方法所需流动相比例平衡系统。平衡系统前用所需方法的流动相比例在排气阀打开的情况下以3ml/min-5ml/min运行一段时间，为了让泵中的流动相比例快速达到所需的流动相比例。 气相色谱 1. 打开氮气、氢气、空气钢瓶，并将钢瓶输出压力调成0.5Mpa 。（氢气输出压力可以设置成0.4Mpa） 2. 打开气相色谱电源。打开仪器工作站，调用运行样品的方法，将进样口、柱温箱、检测器温度升至需要的温度后将检测器点火。 3. 确认进样针没有干涩，如发现干涩不易抽拉问题清洗或更换进样针。更换洗针溶液。 Tips： 1.气相色谱要遵循开机先开气再开电，关机先关电再关气的原则。 2.进样针是经常容易被忽视的部件，开机后一定要确认进样针是否顺滑。 第二部分：质谱篇 液质联用 1.打开氮气发生器的电源，等待压力输出稳定后，调节输出压力约为0.7MPa（约100psi)。 2.液相部分，参考液相色谱开机操作准备。3.打开质谱各板块电源，打开工作站。4.检查真空状态，一般来说，停机较长时间的开机，需要抽真空至少6小时后方可分析样品。 气质联用 1. 气相部分开机参考气相篇，气质联用确认氦气总压大于2MPa，分压调至0.5Mpa。2. 确认质谱放空阀关紧。3. 打开计算机。4. 打开气相色谱及质谱电源。待气相色谱完成自检， 质谱真空泵工作正常（如果机械泵声音不正常，检查侧门和放空阀是否关闭）。5. 确认工作站和仪器连接正常后，调用运行方法，将各部件升至方法所需温度。6. 确认真空泵速率升到100%，真空度达到仪器所需真空度，各部件温度达到方法所需温度。（thermo fisher ISQ只有在真空指示灯显示稳定的绿色达到高真空度时，加热器的电源才会开启，加热器指示灯才会点亮）。7. 通过调谐确认质谱没有发生泄漏。并且氮气、氧气、水的比例达到仪器厂商所需要求。例如Agilent的GCMS 要求：N2<10%,O2<10%,H2O<20%。8.自动调谐报告与关机前状态良好时的调谐报告对比，没有太大偏差。仪器正常。 第三部分：光谱篇 紫外分光光度计 1.仪器开启用电源线连接上电源，打开仪器开关。2.系统自检 仪器开机后进入系统自检过程。3.系统预热 一般要预热20min。 原子荧光光度计 1.打开灯室，将待测元素的空心阴极灯插头插入灯座。注意：插头凸处对准插座的凹处插入；不能带电拔插空心阴极灯。2.打开原子化器室的前门，用洗瓶在去水装置的顶部开口处补加少量水保持水封。3.检查断续流动系统的泵头和泵管，适当补加硅油，旋转固定块将压块压住泵头。4.开启气瓶，调节气瓶减压阀至次级压力在0.2-0.3Mpa之间。5.按微机、断续流动、主机、顺序开启电源 等离子体发射光谱 1.打开氩气（续气 2 小时以上，分压在 0.55Mpa-0.7Mpa之间）。2.检查水循环水量、进样系统（炬管、雾化室、雾化器、泵管 等）是否正确安装，温湿度（温度 20℃-30℃，湿度 20%-50%）。3.启动电脑桌面软件，等待初始化完成。4.新建方法并保存或打开原有方法 。5.确认氩气储量和压力。6.开启排风 →开启循环水机 等待 Camera温度下降到 -45 ℃以下 并稳定，光室温度稳定在 37.98℃-38.02 ℃之间。 7.等离子点火，点火后查看雾化室是否有积液，泵管是否运转 正常，稳定 15 分钟后检测。8.运行校正样品 →查看标样拟合（相关系数） →运行未知样品。

除鉴别和有关物质检查外，HPLC法在化学药物中的应用就是含量测定了，另外在制剂的含量均匀度、溶出度、释放度检验项目中，HPLC法也发挥着越来越重要的作用，但其本质与含量测定一样，都是准确定量的测定方法，因此，含量测定也包括含量均匀度、溶出度、释放度等定量检测项目。1、HPLC法应用于含量测定时需要注意的问题在建立一个新的HPLC法含量测定方法时，方法建立以及方法学验证方案需要特别考虑下述多种因素对分析结果的影响。（1）流动相缓冲盐的pH值流动相缓冲盐的pH值对药物的保留行为有影响，甚至会显著改变某些碱性药物的保留行为。见下图1，当流动相中缓冲溶液的pH为3.0时，出峰顺序为利多卡因、苯甲酰胺、酮洛芬，当流动相中缓冲溶液的pH为10.0时，三种药物的出峰顺序为酮洛芬、苯甲酰胺、利多卡因二即使是梯度洗脱，流动相中缓冲溶液的pH值仍然对药物的保留行为产生影响。(2)色谱柱色谱柱的差异也会影响药物的保留行为，即使是柱长、内径、粒径相同的色谱柱，由于填料性质的差异，药物的保留时间、峰型有时会有较大差异。(3)流动相组成以多元维生素制剂的含量测定为例，某制剂中含有4种维生素：烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1。如图2所示，当流动相中己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠的相对比例由1:1变为4:6时，不仅各组分的保留时间、峰形有变化，甚至峰3、峰4没有实现分离。2、含量的计算方式HPLC的定量方法可以分为内标法和外标法。在仪器发展的初期，由于进样重复性差。为了保证测定结果的准确采用内标法较多。随着自动进样装置的发展，进样的重复性已经足够精密，从90年代开始，大部分的内标法已经被外标法取代。但是，在药典制剂品种中还有一定数量的HPLC含量测定方法采用内标法。除了尚未修订以外，以前担心的进样重复性已经不是采用内标法的原因，主要是因为药品制剂含量测定中样品回收率或样品制备方法的回收率影响，供试品溶液在萃取、离心处理或其他样品溶液制备过程中不能保证样品的完全提取，以及辅料对低含量药物的吸附作用，采用内标法可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。      3、外标法含量计算方式注意事项外标法含量计算公式：含量=m对*P*A样*V样/（m样*A对*V对）*100%（1）样品称样量a、称量方式采用的是加量法还是减量法，都是很有讲究的。正常情况下，肯定要采用加量法，一次称取到位，这样才能得到准确的称样量。b、称量操作称量时，是否足够小心，不会在转移样品时使样品撒漏，这个是非常重要的。 c、样品如果具有挥发性，直接称样时，必然会挥发一部分造成误差；另外，如果样品不稳定，或在溶液中不稳定，那么实际上来讲，也是影响了样品量。还有，样品要保证均匀，固体不必说，液体样品要保证是均相，称量之前要摇匀。（2）对照品含量a、对照品质量对照品是否有合法来源，其含量值是否准确。 b、对照品的保存对照品是否按要求保存，也是至关重要的。因为如果对照品没有按照规定保存，那么其右可能会发生降解，进而影响含量值；另外，如果对照品是保存在冰箱中，称量时，应取出放在干燥器中回至室温再称量，否则其很有可能会吸收空气中的水分，影响含量值。同理，如果对照品引湿性很强的话，长期暴露在空气中，也会使其P发生变化。（3）样品峰面积a、如果所用的分析方法可靠性不好，样品峰面积或保留时间容易变化，那么检测结果也是很重现性不好的。b、如果仪器系统被污染产生残留，而本身峰面积就不大的情况下，这个因素产生的误差就更明显了。 c、如果样品峰形不够好，或者分离度不够好的情况下，积分就很重要。（4）样品的稀释体积a、容量瓶、移液管等体积是否准确。一般来说，新买的容量瓶体积是符合要求的，但是也难免会买到个别次品，这就需要进行校验了。b、容量瓶、移液管规格。这个是很重要的，一般大家都能注意这个问题，做到合理使用。 c、试验习惯问题，容量瓶在使用时，不能使其至于高于40摄氏度的环境下，否则容量瓶会发生变形。d、定量操作，这个包括容量瓶和移液管的使用，注意事项：一是移液管吸液时，液面不要高刻度太多，放液时千万不要用洗耳球吹，并且尽量保持每次操作时间都一样，粘度大的溶液尤其需要如此。二是观察液面时，要使容量瓶和移液管保持垂直，这时很多人喜欢用三根手指捏住，其实这样不容易保持垂直，最好用两根手指，轻轻捏住就好。三是注意接触容量瓶移液管等的面积越小越好，以免体温加热溶液。e、如果对照品和样品没有用同一份稀释剂稀释的话，两者就会有差异，受到温度变化的影响也是不一样的。比如，所用的稀释剂为水：甲醇=50：50，对照溶液用的是上次配好的，然后样品用的是新配的，因为水和甲醇混合会放热，其体积也会增大，等到进样时，样品溶液回至室温，体积减小，就会造成检测结果偏高。f、如果前后室温变化的话，也会造成分析结果的误差。比如，对照溶液进样时，是正常上班时间，实验室开了空调，温度为20℃，而到样品溶液进样时，已经到下班时间了，实验室人员下班时将空调关闭，实验室温度已经降为10℃，这时样品溶液浓度肯定也会增大。g、由于对照品相对比较贵重，一般实验室都会保存一段时间。如果下次分析时没有回至室温，或此时室温与对照品溶液配制时的温度已经发生了明显的变化，都会造成分析结果的误差。h、有些人配好样品后，喜欢用手去握着容量瓶，细心观察的就会发现一会之后液面就明显高于刻度。如果操作者没有注意这点，有的样品立即进样，有的排队过了一会再进样，就会造成误差。

为推动药品注册技术标准与国际接轨，经研究，国家药品监督管理局决定适用《Q3D（R2）：元素杂质》《M10：生物分析方法验证及样品分析》国际人用药品注册技术协调会指导原则。现就有关事项公告如下： 　　一、 申请人需在现行药学研究技术要求基础上，按照Q3D（R2）指导原则的要求开展研究；自2023年7月29日起开始的相关研究（以试验记录时间点为准），均适用Q3D（R2）指导原则，Q3D（R1）指导原则同时停止实施。 　　二、申请人需按照M10指导原则的要求开展研究；自2023年7月29日起开始的相关研究（以生物样品分析原始记录时间点为准），均适用M10指导原则。 　　三、相关技术指导原则可在国家药品监督管理局药品审评中心网站查询。国家药品监督管理局药品审评中心负责做好本公告实施过程中的相关技术指导工作。 　　特此公告。 　　                              国家药监局 　　                            2023年1月19日

液相 节前维护及关机 液相的维护，基本就是柱子的维护。那么，柱子到底要不要拆下来封存？ 个人认为色谱柱冲洗后可以不用取下来的，如果柱子必须卸下的话，管路用管套封口就行。据说用甲醇保存柱子较好，也有的说法是不能用纯甲醇保存柱子，避免盐不能完全冲干净而析出以及溶剂容易变干。 如果是四元泵，四个瓶分别走甲醇、水、磷酸水及乙腈，四个管路怎么处理？ 把四个通道及流路全都置换成70%以上的有机相，溶剂管路最后都要保存在纯有机溶剂里的；避免长菌堵塞管路。 至于玻璃滤头可以不用处理，保存在有机相里即可。 高效液相短期关机和长期关机都要做什么？ 短期关机 1、从泵和系统中除去有害的流动相： 用水冲洗系统中缓冲液盐类，如溶剂蒸发会留下盐结晶等有害沉淀从系统中除去氯仿及其配成的溶液，以免在系统中分解，形成盐酸 2、除去有害流动相后，用异丙醇冲泵及系统，停用仪器可用60/40的甲醇/水冲洗泵、柱和流动池30分钟（柱子要和甲醇/水兼容） 3、关泵、检测器、进样器的电源 长期关机 1、样品测定完毕，先关闭氘灯，减少损耗 2、清洗系统和手动进样阀：根据所作样品不同，关机清洗的方式不一，具体方法如下：  如果流动相是有机相，只包括：甲醇，乙腈，异丙醇，水等；清洗时，只 需用：甲醇100%清洗40～60分钟即可关机。即将水相所对应的溶剂瓶更换为甲醇，将泵的比例调到95%冲洗如果流动相是包含了缓冲盐类，如：弱酸，弱碱（强酸碱绝对禁止注入本机！），乙酸，乙酸铵，三氟乙酸，磷酸，氨水，三乙胺，磷酸盐等。清洗时，需要用：95%水+5%甲醇清洗80～100分钟，再用甲醇100%清洗40分钟方可关机。即将放置缓冲盐的溶剂瓶换成水相，将泵的比率调到95%，清洗80～100分钟，再将水相的溶剂瓶换到甲醇，泵的比率不变，清洗40分钟方可关机色谱柱清洗的时候，不推荐用纯水洗，加入5%甲醇才能保证湿润，否则色谱柱的碳链会发生塌陷，破坏柱子进样阀的清洗原则同上，只是在laod和inject两档都要用清洗液清洗两遍。进样阀严禁停留在，Laod和inject中间清洗的最终原则是在各条管道中都保存足够多的甲醇（最好都用100%甲醇充满），以防霉变。因此在清洗的最后阶段，最好把各个输液瓶都换成甲醇再过一遍。  3、清洗完毕后，在工作站中关闭恒流泵  4、然后依次关闭开检测器，泵A，泵B，柱箱的电源 5、关闭工作站及电脑 6、盖好防尘罩 7、关闭稳压电源 GCMS 关机前的维护 因南北方的气候差异，导致南方湿度大，所以假前一定要做好仪器除湿的工作，才不会节后上班有问题。 需要注意的是： 仪器的关机需要按照步骤来操作，不可走捷径仪器维护过程中要胆大细心，对于不能肯定的方面，需要查相关资料或请教有经验的人员，方可往下操作。 1、软件放空 在仪器操作操作界面点击“视图”，选择“调谐和真空控制”，转换页面后点击“真空”，再选择“放空”,再点击“确定”会现放空界面 2、关闭仪器电源、控制电脑关机 放空完成后，软件会自动关闭，同在质谱示窗上会显示很低的真空度，然后就可以关闭气相的电源、质谱的电源，电脑关机，再将排插插座上的电源线拨掉 3、关闭气源 将氦气瓶的总阀关闭。到此，仪器的关机步骤结束 放假前除尘和离子源的维护 1、除尘 内部除尘：采用吸尘器或软毛刷清洁质谱处的灰尘表面清洁：釆用棉质的毛巾，擦试仪器外表面 2、离子源维护 GC-MS的话，如果要大维护，那就是弄质谱那边了。洗离子源比较费时间，如果比较脏，又不太熟练，一台机弄一天也是常见的事。如果放假之前没啥做的话可以提前关机先把离子源洗了。既然都洗离子源了顺便也看看泵油吧。 前进样口那一大堆东西，分流平板、衬管、隔垫、O型圈等都比较容易弄，可以放到过年回来再弄。如果要老化柱子的话也可以趁着洗离子源的时候顺便弄完。  放假多久色质联用仪才需要关机 我个人认为短时间内不用质谱是没有必要关机的（这里短时间依个人而定，一般是指一周），但质谱部分一般都让它处在只抽真空的standby状态，不消耗氮气（不少公司的LCMS在这种情况下氮气流量可以降到很低）。 真空尽量不关，工程师也是这么要求的，说分子涡轮泵正常维持运行时没什么损耗，开机关机磨损最大。除非放假时间超过一周，否则不会关机。电子开关如果没有断电保护可以关掉，省得万一停电再来电冲击电路板。但是像工作站，液相这些全都可以关，因为质谱抽真空一是比较麻烦，二是要达到定性或定量的稳定状态还是需要比较长的时间，这样来回开机关机对仪器的寿命有损。多于一周以上没用才有关机的必要。 AFS 关机前需要做什么 1、都把硼氢化钾和进样管放到稀盐酸中走几遍2、然后换成去离子水走很多遍 3、最后排空，关掉电源 4、排空后把自动进样针取下来用滤纸包好放置好，泵松开 5、进样管和硼氢化钾的管子放到一个纯净水的瓶子里（瓶子的盖儿上用剪刀挖个小孔，刚好容下两根管插进去，这样防止污染） 6、自动进样臂推至中间位置（因为开始位置有感应器，长期把自动进样臂放在初始位置容易坏） 7、硅油要定期的抹，放假的时候抹容易落灰，产生污泥 8、盖上仪器布。 放假前的维护保养 1、开机一次，让它运行 2、进行管路的清洗，先用稀盐酸然后再用超纯水 3、一切进行完毕，上点硅油，自动进样器上点机油 4、把所有的使用容器都清洗好 5、关掉所有的电源，包括ups 6、用仪器罩将仪器盖好 7、用纯水清洗完以后再抽空洗一次，把管路里面的液体排空，对管路寿命更好 AAS 关机前需要做什么 针对原子吸收光谱仪火焰部分 1、实验结束后，用2%硝酸和去离子水冲洗分别冲洗进样系统5-10分钟 2、冲洗干净后，将进样毛细管从去离子水中取出，排空毛细管中的去离子水 3、按下仪器主机上的熄火按钮 4、打开空气压缩机排空阀，排空压缩机中的积水，关闭空气压缩机 5、关闭乙炔气钢瓶阀门 6、长按光谱仪上的红色按钮20秒，分几次操作，彻底排空仪器中残余气体 针对原子吸收光谱仪石墨炉部分 1、实验结束后，进样针分别吸取20uL的 2%硝酸及去离子水重复测试操作，降低仪器背景 2、停放进样针（--） 3、分别关闭石墨炉电源及光谱仪电源 4、关闭冷却循环水机电源 5、关闭氩气阀门 6、关闭对应的元素灯，退出仪器控制软件 7、关闭光谱仪电源及排风 ICP 关机注意事项 ICP关机的注意事项 1、测试完样品用5%稀硝酸清洗雾化室5分钟，再用去离子水清洗雾化室5分钟后熄火 2、排除甭管内的水，关闭泵，放松蠕动泵管 3、关闭软件、电脑显示屏、主机及打印机 4、关闭测试用气体（氩气和氮气），氮气主要用来测试非金属元素磷和硫用到 5、关闭抽风系统（风机在外面），同时把排风罩放到仪器上面，防止下雨进水到管道，然后进入机器内部，这款仪器是水平的，不容易灌水，看到其他垂直放置的有灌水进去过。同时外面的灰尘也不容易通过管道进去仪器内。所以换是取下来比较好 6、关闭循环水 7、关闭稳压电源（这个电工没处置好，电线有点乱） 8、关闭仪器电源开关及总电源 ICP-MS关机的注意事项 1、实验结束后，用2%硝酸和去离子水分别冲洗进样系统5-10分钟 2、冲洗干净后，将进样蠕动泵管从去离子水中取出，排空进样系统中的去离子水 3、关闭等离子体，松开蠕动泵泵夹，取下泵管 4、等离子体熄灭后，需要一段时间冷却（2min左右）至仪器回到待机状态，再依次关闭冷却循环水机和氩气阀门 5、拉下仪器左侧的主电源开关至OFF位置，等待一段时间后仪器会自动卸真空，关闭排风 6、清洁实验室环境，清除废液，仪器周边不要存放试剂及腐蚀性的酸，保证仪器周围环境清洁 7、数据处理电脑关闭前建议提前备份数据文件，以防数据丢失 其他仪器 关机注意事项 天平 电子天平是几乎所有试验的基础，这位小主可得仔细照顾着，秤盘清空，关闭防风罩，盖好防尘罩（天平的是专用的，出厂包装里有），断开电源。平时工作中每天下班后天平应进入休眠模式，不必关闭电源，第二天使用无需预热，节省工作时间，提高效率。...

很多人在从事药学实验室相关工作的时候，都希望有一份经验宝典能让他们更快的适应以及面对常见问题时能尽快应对，随小编一起来看看药学实验室里面关于分析仪器的使用TIPS吧。 01 有关中药在做中药材的浸出物的检测时，一定要按标准控制好溶剂的浓度（如乙醇等），否则检验结果会差异很大。 中药制剂的溶液（比较稠或量少）要用滤纸过滤时，可以先通过离心的方法使之分层，再去过滤。这样可以加快过滤，减少有机溶剂的挥发（环境温度高时）. 在做人参皂苷RB1和黄芪甲苷时，如果同实验室中酸的浓度很高，这两个成分都会分解，从而测不出含量，所以应避免和挥酸时同时进行含量前处理。中药注射剂检验树脂项时,用的氯仿最好用优级的,不同的试剂对结果影响很大。同时在提取放置的时间尽量长些,使其完全分开。用高效液相色谱仪检测人参、麻黄的含量时因检测波长为边缘波长（203、207nm）往往一次不能成功，特别是使用一段时间后的检测器。可卸掉色谱柱，直接连接检测器，用0.1%的盐酸清洗检测池4小时，效果会好些。中药液相测含量时，因每次配制的流动相有差异，按标准配制的流动相，有时峰分不开，可以在药典允许的范围内适当调整比例，改善效果。在温度低的环境下做一些中药制剂的萃取时，往往会出现乳化现象，即两相不容易分层，这时可加入少量的饱和氯化钠溶液或者用电吹风对分液漏斗加温或用热抹布敷，可以加速其分层。02 有关HPLC方法当液相鉴别中供试品与对照品出峰时间不一致，无法判断是否合格时，可用对照品与供试品各半配成混合溶液后进样，若峰宽未变宽，未出现驼峰，即可判断为合格。做原料残留物检测的时候，如果主药对杂质有干扰，现有方法无法检出，需要自己建方法的话，要优先考虑利用理化性质将杂质分离出来再进行测定。往往有意想不到的效果。 在采用HPLC法测物质含量时，如若流动相中用了缓冲盐，一定要注意其pH值，放置过程中可能会产生变化，而某些药物对这种变化很敏感。 用HPLC法测物质含量时，温度的控制极其重要，最好用有柱温箱的，如果没有就要装空调保持恒温后再测定，否则会出现基线飘移，结果不准确。 有些品种温度的影响非常大,遇到一个品种，对照品溶液不能放在冰箱中,放在液相室内还开着空调,第二天才能做,否则第二天的对照品到中午也不能用。用HPLC法测物质含量时，样品最好用流动相溶解，否则容易产生干扰峰，影响结果，特别有可能出现倒峰，一定要注意。使用含有缓冲盐的流动相，容易堵塞管路和柱子，甚至检测器，如果检测器堵了，最好先不要拆，使用10%甲醇水超声加热一下作为流动相，慢慢小流量冲洗，效果很明显。  用高效液相色谱仪测定含量时，用色谱纯试剂处理对照品和样品，可减少误差。 HPLC检测中，梯度条件容易产生干扰峰，可尝试通过以下几种方法规避：1、使用重蒸后的水或用市售的纯净水（娃哈哈的比较好） 2、尽量选用高波长下检测3、梯度程序尽量平缓4、样品浓度选用线性范围内的最高点。在做片剂或胶囊剂的溶出度实验时，规定药液需经0.8Uｍ的滤膜滤过，但采用液相检测时，进柱前样品还要经0.45Uｍ的滤膜，此时，可以省略第一步过滤，直接做进柱前的样品过滤，否则滤膜会对样品产生吸附，使检测结果偏低。另外不同生产厂家的滤膜对样品的吸附不同，在检测时一定要要注意，可用对照品先做一个过滤前后的对比试验，检查滤膜的吸附。 使用HPLC的过滤装置时 ，一定要注意虑膜的材质，如果是“羟甲基纤维素”不可以过滤含有机相的液体，否则就溶解了，有机相过滤要使用聚四氟乙烯的。 滤膜材质与溶剂的兼容性如下表。 当做高效液相测定肽类时，使用梯度条件情况下，在做第一针样品前，最好走一个空梯度，这样保留时间会一致些。 在用HPLC做定量检测时,柱温和流动相的比例要尽量保持一致,否则,保留时间和积分面积会发生变化,影响最终的检测结果。 在做HPLC时，假如发生重叠峰的现象，通常可以尝试以下几种方法：1、改变流动相成分，如乙腈相改为甲醇相；2、调整流动相比例；3、调整流动相PH值；4、梯度洗脱。高浓度的NaOH标准溶液(比如0.5M)在使用过程中,桶底的部分往往会浓度变高,一般十升的溶液,最下面的一升就不能用了,否则会给滴定结果带来很大的偏差,尤其是夏天。 当液相鉴别中供试品与对照品出峰时间不一致，无法判断是否合格时，可用对照品与供试品各半配成混合溶液后进样，若峰宽未变宽，未出现驼峰，即可判断为合格。用HPLC法测定酚酸等不稳定成分时,可将对照品溶液及供试品溶液调成酸性(可用磷酸等),这样即不会影响测定结果,而且样品也比较稳定,保存时间比较长。PH值一般调到2左右即可!在进行HPLC测定时,所用的水最好是双蒸水,这样对测定结果干扰少,而且要勤换,如果通道生霉,可用异丙醇冲洗通道.有机相如已腈最好滤一下,即使是进口色谱纯溶剂。高效液相色谱柱的维护：1、使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）；2、大多数硅胶基质反相色谱柱的pH稳定范围是2－8，尽量不超过该色谱柱的pH范围；3、避免流动相组成及极性的剧烈变化；4、流动相使用前必须经脱气和过滤处理；5、如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中；6、氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。用HPLC法测物质含量时，温度的控制是很重要，最好用有柱温箱的，如果没有就要装空调保持恒温后再测定。但不至于一定出现基线飘移，更多时候是保留时间的变化，对结果影响也不一定，有时不会影响准确度。在做分析方法验证时，鉴别项的专属性一般都很强，像红外、紫外等，可不做专属性，但是注意显色反应的空白溶液，要保证溶液本身不显色。如果做过三硅三酸镁的检测,是否会遇到这样一个问题:重金属检测时按照标准进行到最后,得到的样品呈现红色,与对照品的颜色(黄棕色)无法进行对照，其主要原是因为在此标准中加入酚酞调节溶液的酸碱度，最后一步加入硫代已酰胺试液后,溶液显碱性，使酚酞显红色。解决的方法是在最后加入盐酸进稍微多加一点,使溶液显酸性,最终使对照与样品颜色一致。在做比色法测定环氧乙烷残留时。若加入品红后等待1h后不见比色管（实验中加入已二醇体积>0.8ml的比色管）呈微红色，则证明实验中所使用的高碘酸失效，需重新配置高碘酸。在含量测定过程中，如果遇到测量结果不准时如何处理？根据经验在测量过程中可以带标准样品（已知含量）和被测试样品同时、平行进行测试。把测试结果和标准样品进行比较即可。这样的话，测试的结果就可以得到修正了。如已知含量的标准样浓度为1.0，而测试结果为0.91，就需要把样品的测试结果除以0.91即可得到相对准确的结果。采用“加标回收”的方法更好。只是相对复杂一些。HPLC测含量时流动相若是乙腈，乙腈最好是新打开的，使用放置时间过长的乙腈容易导致检测不出主峰。在用HPLC测定肝苏胶囊的含量时，其盐酸的浓度相当重要，浓度一定要够才行哟。在做高液时,最好一次把流动相配足但要注意流动相的有效期,如果先配的流动相不够,再用相同的方法去配的流动相继续用,会出现保留时间不一致.其次,在发现流动相不够时,最好不要把流出来的"废液"再收集起来继续用,这样出来的峰面积会增大的。HPLC流动相用到盐的时候，定期用纯水清洗管路，有利于仪器的稳定。用HPLC测氨溴索含量时,片子有包衣,溶剂用0.1%HCL溶解.连续进针后就发现有杂质明显增大的情况.后改进为:用5ml0.1%HCL先溶样品,再用0.5%亚硫酸氢钠定容,就不会出现杂质增大的现象。色谱柱使用一段时间后会出现柱头塌陷，造成双头峰，可用同种牌号的填料将塌陷填平整，即可恢复分离效果，节约检验费用。 不过一般回填效果和使用时间也不会特别满意。用液相色谱法测含量时，跑基线的时间一定要足够长，有时基线虽在短时间内平了，但色谱柱还没有充分饱和，导致在用了柱温箱的情况下，出峰的保留时间也会有很大差异！进行HPLC检测使用磷酸盐缓冲液：乙腈做缓冲液时时，当缓冲液比例小于50％时，由于混合过程是吸热反应，在该过程中磷酸盐会析出晶体，造成流动相混浊而报废。如强行使用会阻塞色谱管道，对于这种情况，可以有以下两种处理方法，一时首先配制50：50的溶剂，然后10％加入，超声至高于室温，在加入10％，再超声高于室温，直至到达所需比例。另一种是首先配制不带盐的流动相，再超声至高于室温后，加入固体盐，超声至溶解，再过滤。 检验杂质时，如果流动相用的是缓冲盐类的，要定期冲洗液相系统，保证杂质的检验准确度。HPLC应用醋酸水溶液作流动相时要注意作完后要长时间冲洗柱子，否则会堵住的。色谱峰出现肩峰不能用时，可以把色谱柱头打开：1、刮掉表面黄色或褐色的填料，用新的同样的填料填补一下； 2、把过滤头用30%硝酸超声30分钟，用纯水超至中性，3、安装柱子，就可以重新使用了。 在做HPLC的梯度洗脱检验时，除了柱温、流动相的PH值、两相比例的比例外，进样时的柱压也是影响出峰时间和形状的一个重要因素，所以进样前流动相的比例、运行时间及进样时的压力要尽量保持一致，才能使试验的重复性符合要求。药物分析，所用的试剂质量很关键，做抗生素的聚合物含量时，经常在聚合物出峰的时间也出现倒峰，查找了所有仪器和溶剂，最后确定是一个化学试剂厂生产的磷酸二氢钠的原因。 在使用一些易挥发性的试剂(如甲醇\乙醇或三氯甲烷)作溶剂时,操作动作要迅速,否则测量结果会比真实值偏高。HPLC如果流动相有缓冲盐时，更换流动相时务必先将缓冲盐更换掉，否则会将堵塞色谱柱。分子筛色谱柱的使用：一般而言分子筛色谱柱不如反相色谱柱的寿命长，有时维护不好做上两百多个样品就不行了，所以每次使用完一定要充分地用超纯水把盐冲洗干净，并且用0.05%的叠氮钠保存，一般冲洗两小时就可以了。曾经也低速冲洗过夜的，后来发现可能是水对硅醇基的影响反而降低了柱子的寿命，就改了。可以在软件上设置自动关泵，就不用人一直看着啦。做HPLC时，样品稀释好后是需要过滤的，最好选用与生产使用的同等材质的滤膜，这样就不会产生偏差了。做液相自己经常容易犯的错误： 1、排气泡不彻底，柱子冲了半天都难以平衡；2、更换流动相后，瓶子的体积忘记修改，结果不是进气泡就是中途强制停止运行；3、走序列时，忘记勾选shut down，以致到了早上出错报警；4、缓冲液的pH一定要调节准确，否则对RT很有影响的；用HPLC法测物质有关物质时，样品放置的时间以及放置的温度极其重要，所以最好现用现配，或者配好的样品液一定要低温保存，条件允许的话可以加一个自动上样控温装置，这样可防止杂质的降解，保证结果准确度。走访过很多药厂，查看HPLC时大多数都可以在泵头和管路连接处发现有白色的结晶出现。产生这种结晶的原因是使用了含缓冲盐的流动相后，对系统冲洗时间不够，管路中残留了少量的缓冲盐随流动相渗出造成的。如果发现相同的问题，只要延长冲洗时间就可以解决。 做滴定时一定要注意所配溶液是否和以前的溶液的性状相同（如：颜色），如果不同就要考虑试剂、溶剂和器皿是不是变质或被污染了。做紫外时因重视仪器的预热时间，预热时间太短，对实验结果的影响很大。 看到有很多实验员在配置薄层板的CMC-Na溶液时喜欢加热，使其快速完全的溶解。这样做有一个很大的弊端，制作出来的薄层板是非常不平滑的，建议还是让其自己慢慢溶解，即时不能完全溶解，也可以使用。 岛津的HPLC-10A的部分仪器对乙腈非常敏感，如果流动相中含有大量的乙腈时因逐步过度，否则会产生漏液或压力不稳定。做HPLC时使用低波长时，水的纯度要求要比高波长要高一些。比如210nm以下波长检测时。HPLC中流动相中加了三乙胺可以减小拖尾,关键是PH值。在做液相时候，如果保留时间不一致，看看室内温度变化情况，还有就是你要是手动进样时，进样速度也有关系！ 在做不同厂家同一原料药的熔点时发现该原料药的熔点均不符合规定，在查、做液相时如果流动相有缓冲盐，一定要注意你的色谱柱的 冲洗。不然峰的分离度不好。03 有关气相方法做药品有机溶剂残留量检查时,可以不拘泥于规定的色谱柱, 通常的DB-624可以满足要求, 取样量也可以灵活调整, 标准溶液浓度根据限度做相应调整就可以了。 在做有机溶剂残留时要注意载气流速一般柱流速在1-3ml较好，太大样品重复性不好，尾吹气流量也需注意。用GC测有机残留水不溶性成分时，如苯、二氯甲烷等，称取毫克级标样时，在量瓶底部预先加少量DMF/DMSO，会减少天平的跳动，帮助准确称量。

中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）在其网站公布了关于公开征求《门冬氨酸鸟氨酸注射液药学研究技术要求（征求意见稿）》、《盐酸托烷司琼注射液药学研究技术要求（征求意见稿）》意见的通知，标志着全球首个仿制药药学研究技术指南诞生。 之前美国FDA会公布单个药品BE研究指南（guidance），后来cde也有样学样，陆续公布单独品种的BE研究指南。而今，cde公布的《门冬氨酸鸟氨酸注射液药学研究技术要求（征求意见稿）》，标志着CDE已经青出于蓝而胜于蓝，取得了巨大突破。这也是中国这三十年来药学研究与审评的巅峰。中国药学研究的能力、产量太突出，全球首个仿制药药学研究技术指南的诞生也是水到渠成。 我们来看看全球首个仿制药药学研究技术指南长啥样。 为什么要制定 《门冬氨酸鸟氨酸注射液药学研究技术要求（征求意见稿）》 一、起草背景 门冬氨酸鸟氨酸注射液参比制剂信息曾在 CDE官网参比制剂目录（第二十二批）公示，将德国麦氏公司（MerzPharmaceuticals GmbH）生产的国内上市的原研药品作为参比制剂（商品名雅博司(Hepa-Merz)，规格 10ml：5g）。本品参比制剂公示期间收到反馈表示异议，参比制剂未正式公布。后根据一致性评价工作会及中心工作会要求，本品不推荐参比制剂。为促进门冬氨酸鸟氨酸注射液的质量提升，需制定该品种的技术要求。 二、起草内容与说明 概述部分，说明门冬氨酸鸟氨酸的作用机制及本品适应症，明确本技术要求适用范围，同时强调了本技术要求仅代表药品监管部门目前对于本品的观点和认识。 整体研究思路部分，重点说明尽管本品不推荐参比制剂，但建议选择德国麦氏公司的上市品Hepa-MerzR作为药学研究的质量对照制剂。并明确要求自研制剂质量不得低于质量对照制剂。 药学研究技术要求部分，首先明确了总体要求，并在此基础上提出重点需要关注问题的指导性意见，主要包括处方方面关注原辅料来源及质量要求，制备工艺方面关注灭菌、充氮工艺研究，质量研究方面关注有关物质、吸光度及溶液颜色等方面的考察，稳定性研究注意配伍稳定性研究，包材相容性方面关注相容性和密封性等的考察等。 门冬氨酸鸟氨酸注射液药学研究技术要求（征求意见稿） 一、概述 门冬氨酸鸟氨酸（ OrnithineAspartate）是鸟氨酸和门冬氨酸在一定条件下反应形成的水溶性盐，其在体内通过产生两种氨基酸——鸟氨酸和门冬氨酸，作用于两个主要的氨解毒途径——尿素合成和谷氨酰胺合成。门冬氨酸鸟氨酸注射液临床用于因急、慢性肝病引发的血氨升高及治疗肝性脑病。 门冬氨酸鸟氨酸注射液不推荐参比制剂。为促进门冬氨酸鸟氨酸注射液的质量提升，特制定本技术要求。 本技术要求仅代表药品监管部门目前对于本品的药学研究的观点和认识。在符合现行法规要求的前提下，可采用替代的研究方法，但应提供详细的研究资料或与监管机构进行沟通。 二、总体研究思路 本品不推荐参比制剂，建议选择德国麦氏公司（Merz Pharmaceuticals GmbH）上市品（商品名 Hepa-MerzR，规格10ml：5g）作为药学研究的质量对照制剂。自研制剂与质量对照制剂药学的对比研究应全面且充分，自研制剂质量不得低于质量对照制剂。 三、药学研究技术要求 自研制剂应基于注射剂仿制药的技术要求和产品特点进行研究，应满足《化学药品注射剂基本技术要求》及《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》等相关要求。此外，研究中还应重点关注以下内容： 1、处方 自研制剂的辅料种类和用量通常应与质量对照制剂相同。原辅料应选择登记平台标识“A”或关联审评通过的品种。 本品原料药应为门冬氨酸鸟氨酸，其质量应满足自研制剂的质量需求，内控标准应不低于现行版中国药典要求，同时建议关注手性中心引入的异构体研究（如比旋度、异构体检查等）。原料药有关物质研究与限度规定可参考ICHQ3A相关要求，对于超过鉴定限的未知杂质应进行研究和评估。 2、制备工艺 应提供详细的生产工艺研究资料和工艺验证资料（包括无菌工艺验证资料）。建议制定合理的生产过程控制策略如关键步骤的生产时限、关键中间体的质量控制标准和保持时限等。 建议结合本品特性对充氮工艺进行研究，考察充氮与否对产品质量的影响，确保自研制剂稳定性不低于质量对照制剂。 需按照灭菌工艺选择决策树进行灭菌工艺的筛选，建议采用过度杀灭的灭菌工艺。 批量应符合化学仿制药注册批生产规模的一般性要求。 3、质量研究 自研制剂应与质量对照制剂关键质量属性（CQAs）一致， 并与质量对照制剂进行全面的质量对比，保证自研制剂不低于质量对照制剂质量。应提供多批次质量对照制剂考察数据。除注射剂一般质量属性及控制要求外，建议关注： （1）建议结合原料药结构特点以及制剂的生产工艺，全面进行杂质研究，重点关注降解产物（如现行版中国药典门冬氨酸鸟氨酸中规定的特定杂质Ⅰ和杂质Ⅱ等），对于制剂稳定性研究中（如加速试验、长期试验等）超过鉴定限的降解产物建议进行归属研究。有关物质检查应优选专属、灵敏、精密、准确度高的分析方法，并关注方法对不同性质杂 质的检出能力，必要时应选择不同方法。制剂有关物质分析方法的检测能力应与原料药方法相匹配。根据质量对照制剂说明书，本品最大日剂量为  40g，未知单杂限度应严格至0.10%，已知特定杂质和杂质总量需结合自研制剂与质量对 照制剂实测结果拟定合理限度。 （2）建议测定本品在  420nm波长处的吸光度，并增加溶液的颜色考察。建议开展相对密度、折光率相关研究。  4、稳定性研究 稳定性考察关键指标应包括性状、pH值、有关物质（包括未知单杂和杂质总量）、吸光度、溶液的颜色、异构体、含量、不溶性微粒、可见异物等。 按照质量对照制剂说明书的用量要求，配伍稳定性研究应至少考察5%葡萄糖注射液、0.9%氯化钠注射液等常用配伍溶剂的配伍使用情况，考察时间至少 6小时以上，考察指标 除常规项目外，与葡萄糖注射液配伍时还应增加5-羟甲基糠醛检查。 建议对低温、冻融试验进行研究。 5、包材相容性 应结合产品特点、稳定性、包材相容性和容器密封性等 研究结果证明包材选择合理。包材相容性和容器密封性应参照相关指导原则进行研究。  四、参考文献 1. 德国麦氏公司（Merz PharmaceuticalsGmbH）Hepa-MerzR（商品名）说明书 2. ICH-Q3A《新原料药中的杂质》 3.国家药品监督管理局.《化学药品注射剂基本技术要求（试行）》（2008年1月） 4.国家药品监督管理局.《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》（2020 年 5月） 5.国家药品监督管理局药品审评中心.《化学仿制药注册批生产规模的一般性要求（试行）》（2018年 6月）

很多有机化学实验书籍中提供了有机化学实验的基本知识和必要手段，但是仅仅借助这些手段进行那些已经被前人重复过多次的经典实验，很多人常被接踵而来出现的一些意外的问题所困扰，这些问题在一般的有机化学实验书籍很难找出直接答案和解决途径。例如提取时发生乳化、产物结晶不出、混合物难以分开、合成目标化合物的产率低等。我结合前人的经验及在有机合成中的工作经验，围绕有机合成反应的后处理操作，针对研究工作中在7个方面可能遇到的困难和容易疏忽的问题，分别提出比较系统的解决方法。 1 搅拌 目前，国内外一些专门做有机合成的实验室，基本上以电磁搅拌替代机械搅拌，特别是涉及到对空气、水汽敏感的且具有高度反应活性化合物的反应。搅拌使用的四氟乙烯磁棒有多种规格，例如条形磁棒用于圆底反应瓶中物料的搅拌；三角形磁棒用于尖底反应瓶中物料的搅拌。国外学者认为对有机合成实验室的绝大多数反应而言，磁棒搅拌的强度也已经足够了；若需要处理高粘度产物中的悬浮固体，或进行大量制备(大于2000mL的反应体系)，或需要高速搅拌时，则必须用机械搅拌。与机械搅拌相比，电磁搅拌具有安全性高、使用方便、操作简单的特点。2 加热 在诸多的加热方式中，一般使用最多的是浴液加热。加热浴液有硅油、液体石蜡。硅油是有机合成实验室中最安全、最常用的导热介质；这是由于硅油在3o0~c左右长时间加热而不变黑不发烟。液体石蜡加热到lOO~C以上时易变黑且易发烟。因此，有机合成实验室常用液体石蜡代替水作浴液，用于lOO~C以内的反应，特别是对于无水反应。除了做冰水浴，有机合成实验室基本上不用水做浴液。 3 过滤 采用玻璃砂芯漏斗减压过滤是一种方便快捷的过滤方法。通常采用3#砂芯过滤；对于更细的一些固体颗粒，可以采用4#砂芯过滤。此外，对于含部分有色物质或树脂状物质的样品，可以在砂芯漏斗的底部铺一层吸附剂(硅酸镁、硅胶、氧化铝)，然后再减压过滤，这样可以在减压过滤的同时除去样品中的这些杂质。若需要趁热过滤，可用电吹风加热砂芯漏斗(过滤前和过滤过程中)，保持体系一定的温度。 4 萃取 由萃取的原理可知，萃取剂必须对被萃取液中的溶质具有尽可能大的溶解度，与反应体系的溶剂不溶。因此在提取以前，必须对反应体系加以适当的处理。例如，以高锰酸钾在吡啶一水介质中氧化芳烃的侧链，此时生成的酸以钾盐的形态存在，为了用水把它从大量的、由氧化剂形成的二氧化锰中萃取出来，在反应完成之后，应该尽量彻底地将吡啶蒸除，必要时可减压蒸馏。否则吡啶进入萃取液，酸析时造成产品酸的溶解损失。同样，当欲以有机溶剂对反应产物进行萃取时，必须从反应系统中蒸除水溶性的溶剂，诸如低级醇和四氢呋喃等。 在通常的萃取操作中，常采用单一的有机溶剂作为萃取剂；但实际上采用混合有机溶剂作为萃取剂，萃取的效果会更好。这在选择萃取溶剂时必须考虑到。乙醚一苯、氯仿一乙酸乙酯、氯仿一四氢呋喃等都是良好的溶剂组合。例如二元羧酸，它在氯仿中通常是难溶的，但只要向其中加入10％的四氢呋喃，氯仿对二元羧酸的溶解度便将显著增加。在进行这类溶剂组合时，必须考虑到比重因素。 如果直接用溶剂萃取产物，应该牢记“用少量溶剂多次萃取”的原则；但是首次所用的溶剂的量宜大一些，一般为被萃取体系体积的1／3。如果要向反应体系中加入水，然后再用有机溶剂萃取，则应控制所加水的体积。原则是在保证水充分溶解反应体系中的全部无机物的前提下，尽量用水少一些·9即配成适当浓度的无机盐溶液而便于高效萃取。将萃取得到的有机相合并，用饱和的氯化钠水溶液或硫酸铵水溶液洗涤1次，最后将洗涤后的有机相用干燥剂(常用无水硫酸钠)彻底干燥、浓缩，即可得到彻底除去反应体系的水溶性物质。用饱和氯化钠水溶液(适用于中性和碱性产物)或硫酸铵水溶液(适用于酸性产物)洗涤的目的是降低水在有机相中的溶解度，除去萃取剂中溶解的水份，便于用有机相的干燥。 在提取时，必须考虑萃取剂相对于被萃取液的比重。比重不仅是决定两相是否容易分层的重要因素，而且关系到操作的方便与否。当萃取剂比被萃取液的比重大时，每次振荡分配之后，只要将下层溶液放出来，就可进行第二次提取。反之，如果萃取剂处在上层，则必须放出被萃取溶液，从漏斗的顶部倾出萃取液，再将被萃取液重新加入漏斗之后，才能继续操作。两种方法相比，前一种方法操作简单，样品损失少。 为使酸性或碱性的有机物从有机溶剂进入水相，可相应地用碱或酸的水溶液进行提取。将酸从有机溶剂中萃取出来的完全程度，取决于萃取液的碱度，这碱度必须保证将酸实际上完全转化为盐。一般可近似地认为，萃取液的pH至少应该比被提取的游离酸的pKa值大4个pH单位。例如，碳酸钠的水溶液的pH约为lO，它能将pKa低于6的酸萃取出来。同样，当用酸从有机溶剂中提取碱时，酸溶液的pH值应比被萃取的有机碱低4个pH单位。对萃取得到的水溶液进行酸化或碱化，酸性或碱性的有机物便从水相析出而重新进入有机相，或者直接析出。这是一种常用的精制程序。萃取剂对于杂质的溶解也是一个值得重视的问题，特别是某些极性有机溶剂对无机盐的溶解是不能忽视的；否则，部分溶解的盐便混入产品。在某些情况下，酸性(或碱性)水溶液对于有机碱(或有机酸)的萃取效果并不好。例如，用稀的无机酸萃取弱碱性的胺，用碱水溶液萃取具有立体障碍的有机酸或酚类时，情况往往如此。此时应尽可能地降低有机相的极性。用苯代替乙醚、向有机相中加入己烷等都是极有效的措施。 在萃取时常常出现不分层的现象，这多半是由于对萃取的准备不足或考虑不周造成的。当存在一种溶剂(如吡啶、低级醇、二烷等)与两相都能良好地互溶且体积较大时，解决的办法是向体系中加入更多的、彼此不互溶的两种溶剂，从而降低引起总体互溶的溶剂的相对量。加入饱和无机盐溶液也是有效措施。但这样的问题关键在于预防，例如在萃取前将这些溶剂(如吡啶、低级醇、二烷等)彻底蒸去。在萃取时有时也析出固体有机物。出现这一现象的原因是作为反应体系溶剂的有机相因部分溶解于萃取剂而减少了，或者是反应体系中存在一种物质(例如醇类)对于固体有机物在有机相中的溶解起着很大的作用，而一经水洗，这类物质进入水相，于是有机物在有机相中的溶解度大为降低。对于这种情况，只要再加一些同种或更有效的有机溶剂，就能使固体重新回到溶液中去。不互溶的两液相不能完全和清晰地分层，界面上存在着一层乳浊液，这是萃取时经常遇到的乳化问题。这种现象有时只要静置几分钟即能自行消失，有时却能持续数小时乃至数天。如果乳浊液的体积小，不妨暂且置之不理，而继续萃取(将乳浊液并入所需的一层)；如果乳化层很厚，而又不容许长时间等待，就必须根据其成因而采取某种解决措施。若因两相间的密度差太小而造成的乳化，可向其中一相或两相中加入适当的物质，使其密度差增大。例如戊烷能使有机层的比重明显降低，四氯化碳则相反。对于水相通常是加入无机盐，这既能增加水相的比重，又能显著地降低有机物在水相的溶解度。对于因表面活性剂存在而形成的乳化，改变溶液的pH往往能使其分层。对于碱溶液所形成的乳化，加入几滴醋酸有时颇为有效。因少量悬浮固体(树脂状物质或有色物质)引起的乳化，可将乳浊液缓慢过滤；过滤时在漏斗里铺上一层吸附剂(硅酸镁、氧化铝、硅胶)，则效果更好。对于顽固的乳化，还可用离心分离，也可加热，或向有机溶剂中加入极性溶剂(如醇类或丙酮)以改变两相的表面张力，这些措施都能有效地破坏乳化。 必须强调，预防乳化比事后消除更为重要。在开始时只将萃取液慢慢地渗入被萃取液中，或只是轻轻地旋荡，乳化的倾向是能够被抑制的。长时间匀缓混合是预防乳化的最有效办法，切忌盲目地猛烈摇荡。在极端情况下，可以在尖底瓶中利用三角形磁棒搅拌来进行萃取，为达到平衡，有时甚至需要搅拌半个小时甚至1h之久。 5 减压蒸馏 对于很多步合成得到而显得格外珍贵的高沸点的粘稠油状物，常常不得不以减压蒸馏的方式加以提纯。对于压力在15mHg以上的蒸馏采用水泵减压即可；若压力低于15mUg以下的蒸馏必须采用油泵减压。在用油泵减压进行大规模的减压蒸馏时，要尽可能地采用容量大的油泵，例如10g的油状样品在蒸馏时必须使用容量至少为4L·s 的真空油泵。使用油泵时，谨防灰尘和低沸点液体混入，并需定期更换泵油。油泵是中真空度(小于l5n {g)专用的，决不能贪图方便而偶然地用于低真空度的蒸馏。整个蒸馏装置的所有磨口处均须采用封口膜进行密封，或涂抹高真空润滑脂以保证系统高度密封。在真空状态下，一定量液体所产生的蒸气体积比lama下大好几千倍，故防止液体暴沸显得特别重要。在真空条件下，防止暴沸的最佳手段是磁棒搅拌 6 结晶 在层析技术产生以前，结晶一直被认为是一种艺术(art)，特别是分步结晶更是一种细致、巧妙的实验技术；因为结晶的成功与否，在很大程度上取决于实验人员的经验。结晶的关键是选择溶剂。对结晶溶剂要求是lOOmg的固体样品能在加热至溶剂沸腾时能完全溶解在0.5～1.0mL的溶剂中，且在冷却后能获得收率为8o％以上的良好晶体。 在实验中要注意： ①有些固体的溶解速度很慢，不能过早断言溶剂的适用性； ②有时因为过饱和作用，晶体不能很快析出，不能过早地认为所用溶剂太多或溶解度随温度变化不大； ③有时不溶的部分是杂质，而非所希望的产物。 ④如果经过重结晶而产品的质量并无明显改变，则可能是杂质的溶解和析出情况随温度的变化恰巧与主要产品同步。此时必须更换结晶溶剂或采用其它的精制手段。 若按照常规进行结晶遭到失败，可以考虑采用以下的经验方法： ①将待结晶样品溶于乙醚，冷却后，钢质刮铲或玻璃棒摩擦器壁促使其结晶。 ②选择至少用两种不同的展开体系对样品进行薄层层析，据此了解样品的主要组份的大致比例、杂质的数目。若样品中杂质的Rf值与主要组份的相差较大时，可以将待结晶样品溶液通过短的层析柱，然后再进行结晶便可得到较好的晶体。 ③将待结晶样品溶于乙醚等易挥发溶剂中，补加溶剂，配成稀溶液，置于通风厨内待其自然挥发。经两、三天就可以看到在器壁上粘附的结晶，而粘稠的油状物凝结在容器底部。小心刮下壁上的晶体，进一步处理即可得到良好的结晶。 ④ 给样品中加人溶解度不大的溶剂，使其部分溶解，然后用磁棒缓缓地搅拌使自然溶剂挥发，最后可以在器壁上得到良好的结晶。这样缓慢挥发溶剂常比放人冰箱中冷冻更为有效。 在制备反应中，得到油状粘稠粗产物是很常见的事情。如果在做了正常的处理之后样品仍然呈油状，而样品如结构和现实产物的状态(如很粘稠、冷冻时成为无定形固体等)判断它应该成为固体，则必须设法使其结晶。产物因严重不纯呈油状，而油状本身又成为杂质的良好溶剂，一旦除去了其中的杂质，产品便易于结晶；另一方面，往往又需要通过使其成为晶体的方式才能除去其中的杂质。当产品的熔点较低时，这类油状物往往很难结晶。　　 对油状物进行结晶时需要注意：①加入溶剂后加热要适当，溶解温度不宜过高，注意分清样品的溶解和熔化。②使用较大量的溶剂配成稀溶液，在低温下进行结晶。③冷却的速度要慢，不能过早将样品放人冰箱。④ 由于特别容易形成油状物的低熔点固体在非极性溶剂中有很大的溶解度，故常选用溶剂对使其结晶。 ７ 层析柱 在反应产物的分离过程中常用到加压(0.5kgf／cm2～ 1.0kgf／cm2)柱层析技术。常用硅胶和氧化铝(4or,)作为吸附剂，用氮气加压或用加压球加压，将所需样品在2～4h分开。快速柱层析的操作的关键是选择适当的洗脱溶剂、装柱、上样。 洗脱剂的选择是以薄板层析为基础进行摸索的。选择洗脱剂要解决2个问题：洗脱剂的选择性和洗脱剂的强度 J。洗脱剂的选择性是指所选溶剂体系对某一样品所能分开的程度，包括在层析薄板上分开的组分数目和相邻组分之间Rf的差值。一个洗脱溶剂体系的选择性取决于其中有机溶剂的种类；体系中极性较强的组分对其选择性起主导作用，而弱极性组分对其选择性影响不大。因此要改变洗脱溶剂体系的选择性的主要途径是改变洗脱溶剂体系中的强极性组分。如果一个洗脱溶剂体系在层析薄板上将某一样品所能分开的组分数越多，相邻组分之间的Rf差值越大，则该洗脱溶剂体系的选择性越好。通常采用2种有机溶剂组成的洗脱体系；若2种有机溶剂组成的洗脱体系选择性较差，可以考虑3种有机溶剂组成的洗脱体系。 在确定了柱层析所用洗脱剂的种类之后，下一个要解决的问题就是洗脱剂的强度问题。洗脱剂的强度是指所选择溶剂体系中各组份的相对比例，也可以看成是溶剂体系的极性。如果溶剂体系的强极性组分越多，则该体系的极性越强，它对样品的洗脱能力越强。通常采用在硅胶薄板上将所需组份能推到Rf在0．20～0．25的溶剂体系作为柱层析的洗脱剂。总之，若所分离的样品越简单，则可以使用极性稍强的洗脱剂；相反，则可以使用极性稍弱的洗脱剂。 对于合成样品的分离，常采用干法装柱。通过对几种不同装柱程序的比较，笔者认为按照以下程序所装的层析柱效果最佳。装柱程序：① 向层析柱(30cm)中填装吸附剂(40p)；② 用水泵从层析柱下端减压，使得吸附剂柱床变得密实均匀，使得吸附剂柱床长度为15—20cm；③ 向吸附剂柱床中缓慢地加适量的弱极性溶剂(通常用石油醚)，然后向柱顶的溶剂中加入厚度均匀的石英砂(1crn左右)，保持该溶剂液面始终在石英砂层以上。④ 在减压条件下，让弱极性溶剂完全浸湿吸附剂柱床，排除其中空气即完成装柱工作。 柱层析上样分为干法上样和湿法上样。值得注意的是，对于极少量样品的分离，例如20nlg样品的分离，笔者认为干法上样(用200—3OO目的吸附剂拌样)比较好；因为该法上样时样品界面很整齐，分离效果好。在干法上样完毕后，再按照上述方法在样品层上加石英砂层(1cm左右)完成上样过程，然后可以进行加压洗脱。 在加压柱层析操作中要注意：①层析柱吸附剂柱床的最佳长度为15-20era。柱床过长则分离所需时间越长，消耗的溶剂越多，柱床过短则分离效果差。②洗脱剂的流速要快，溶剂呈线状。流速过慢可使得本来在柱床中分离开的几个组分又扩散到一起。③洗脱剂强度的梯度增加要小，以免几个组分同时被洗脱下来。对于洗脱下来的组份，若有紫外吸收，可在紫外灯下进行检测；没有紫外吸收的样品常可通过钼酸铵溶液、高锰酸钾溶液、碘等使其显色来检测。

概述 在药品研发中，质量研究是重点。参考指导原则，现将质量研究分成四个部分：质量研究项目的选择及方法初步确定；质量标准的方法学验证；质量对比研究；质量标准的制定。 质量研究项目的选择及方法初步确定 质量研究项目的选择及方法初步确定：可称为质量标准草案的初步建立（此项工作应在辅料相容性试验之前完成）。 1、遵循“就高不就低”的原则。结合所查询的产品质量标准（原研标准、国内首仿标准、药典标准）和药典对具体剂型的要求，确定出质量标准草案。静脉注射剂处方中加有抗氧剂、抑菌剂、稳定剂和增（助）溶剂等，眼用制剂处方中加有防腐剂等，应对相应的辅料进行定量研究。 对于国家药品标准中收载的项目，首先应考虑选用标准中收载的检测方法。 2、若有关物质检测方法多种并存时，建议初步对比研究来确定方法。如有杂质对照品，用杂质对照品来确认方法的可行性；如没有杂质对照品，可做一强制降解试验（需要特别注意的是降解程度为10%左右，在此情况下判定物料平衡才有意义），来初步判定检测方法的可行性。 判定标准：有杂质对照品时，系统适用性、分离度、有效检出、精密度及重现性。 无杂质对照品时，系统适用性、降解杂质的有效检出、物料平衡。 3、质量标准草案的初步建立。 质量标准的方法学验证： 具体分为两个方面：方法的初步验证和系统的方法学验证。 1、质量标准的初步验证（在中试之前完成）： ①在配合处方工艺筛选检验时，就是质量标准初步验证的过程。例如辅料相容性试验、参比制剂与小试产品的对比检验、小试产品的影响因素试验等，就可以对方法的可行性进行一个初步的判断。 在这时，方法学研究偏重于验证国家标准中的检测方法和条件是否适用，重点考察方法的专属性和准确度。如方法学研究结果显示方法不适用，应首先分析原因，通过调整处方工艺等以使方法适用； 在原因无法确认的一些极端条件下，才考虑建立新的检测方法，但新方法首先要按照化学药物质量控制研究相关指导原则进行研究，还需通过比较研究证实与原方法具有同等的控制程度。 因此，原则上不要更换已有的国家药品标准的色谱条件。当分离度达不到时，可适当调整流动相的比例。 讨论：在前期的处方筛选中，质量标准并没有真正建立，最终确定的质量标准可能不一样。这种情况下，认为处方筛选的数据仍然可以放入申报资料中，这和处方筛选的目的并不背离，同时也反映出质量研究的开展过程。 ②出具三批小试样品的检验报告书。 2、系统的方法学验证： 在初步验证的基础上，需对质量标准进行系统的方法学验证。方法学验证所用样品应采用中试产品。 验证项目（品种及剂型不同检测项目不同）： ① 性状；鉴别(理化鉴别和光谱鉴别)； ② 一般检查项（按中国药典制剂通则）； ③ 微生度检测（需进行完整的方法学验证试验）； ④ 溶出度，有些可以和含量一起验证； ⑤有关物质（需进行完整的方法学验证试验）； 含量测定（需进行完整的方法学验证试验）、卫生学方法学验证。 其中重点是有关物质和含量的方法学验证。 3、有关物质验证的内容有： （1）系统适用性： 取样品，按照有关物质供试品浓度配制溶液，进样，记录图谱。理论板数应符合规定，分离度应大于2.0或符合规定、拖尾因子应0.8-1.2或符合规定。 有已知杂质并且杂质对照品可获得的：配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，保留时间的相对标准差应不大于 1.0%。另外，理论板数应符合规定，分离度应大于 2.0或符合规定、拖尾因子应0.8-1.2或符合规定。 （2）专属性： 空白溶剂干扰试验、空白辅料试验、强制降解试验（高温、强光、强氧化、强酸、强碱等）、已知杂质定位试验、峰纯度检查（二极管阵列检测、质谱检测）。 （3）检测限与定量限： 一般采用信噪比法。有已知杂质并且杂质对照品可得的，须用已知杂质对照品同时做。信噪比10：1，为定量限；信噪比为3：1，为检测限。 （4）线性关系试验： 至少要做五个浓度，如 60%、80%、100%、120%、140%（相对于自身对照浓度）的系列溶液。取该系列溶液进样，记录色谱图，计算回归方程。 若有已知杂质并且杂质对照品可得的，则取已知杂质对照品另作线性关系试 验，供试品中已知杂质峰面积，应在线性范围内。 （5）精密度： 只做重复性和中间精密度即可。 （6）溶液稳定性： （6）准确度： 一般以回收率试验进行验证。无已知杂质的，可不做。有已知杂质的，须做加样回收试验验证准确度。 讨论：有关物质的检测中，要检测的是杂质，而不是原料。因此，认为在有已知杂质对照品，并且在标准中对此杂质进行了单独控制的时候，方法学验证的内容应围绕着已知杂质展开，不可以用原料来代替。当无已知杂质对照品时，才用原料代替。 在做强制降解试验时，建议同时用空白辅料平行做强制降解试验，特别是含有特殊辅料的，如防腐剂等在紫外有吸收的辅料。关于强制降解试验，不仅是方法学验证的内容，而且是对产品的降解途径、杂质谱及产品稳定性判定的过程。 仿制药相关指导原则要求仿制品与原研药应比较杂质谱、杂质量及降解途径。因此，建议把研试品与原研药平行进行强制降解试验（均约10%），这样可以直观比较两者的降解途径是否一致；降解物是否有差异；检查方法对两者的专属性差别（由于拟定的方法多是原研药的检测方法）。平行对比破坏性试验研究，是评价研制药和被仿药质量是否相同的重要手段。 4、关于强制降解试验中物料平衡的问题： ①首先，降解强度为10%左右，不超过10%。 ②有杂质对照品时，计算出校正因子，将校正因子代入计算。 ③做峰纯度检查（二极管阵列检测），二极管阵列检测的作用不仅是峰纯度检查，另外，还反映出杂质及主药的总体紫外吸收情况。可以计算在不同波长处的物料平衡情况（按具体品种而定）。 ④计算方法：通过与正常样的总峰面积对比。具体做法：建议取一定量的样品溶解，作为母液，分别从母液中取一定量进行个因素的降解试验，再与此母液做的正常样进行对比，这样做出的结果才可靠。 出具三批中试样品检验报告书。 质量对比研究（采用中试产品）： 质量对比研究是判断仿制药与被仿制药质量 “一致性”或“等同性”的重要方法，可以全面了解产品的质量特征，为仿制药注册标准的建立提供依据。 1、溶出曲线对比研究： 一般采用在四种溶出介质（PH1.2、PH4.5、PH6.8.水）中的溶出曲线对比的方法，用f2因子法（f2>50）来比较原研药和仿制品的曲线相似性。 注意事项： ①用于比较的两种制剂含量差值应在 5%以内。 ②计算时所选取的时间点间隔无需相等，但两制剂所取时间点必须一致；且计算时间点应不少于 3个；由于该计算结果有依赖于比较时间点个数的特性，故在溶出率 85%（缓释80%以上）以上的时间点应不多于一个。溶出量应按累计溶出量来计算。 ③除 0时外，第一选取时间点溶出结果的变异系数应不得过 20%，自第二时间点至最后时间点溶出结果的变异系数应不得过 10%。如超出，应从仪器适用性或样品均一性的角度考虑予以解决。 2、杂质的对比研究（此项内容可与方法学验证同做）： 对于有关物质检查，由于原料药制备工艺、制剂处方工艺的不同，仿制药的杂质种类和被仿制药可能不同，因此要求进行对比研究，分析仿制药和被仿制药中杂质的种类和含量情况。 ①可通过强制降解试验及影响因素试验的对比研究，来比较仿制药与原研药的杂质种类、降解途径及杂质大小。 ②对于复方制剂来讲，首先应对杂质进行归属。采用方法：分别做单个原料、空白辅料及制剂的强制降解试验。 要求如下： 如果研制产品中杂质的含量超出了国家标准规定，或者研制产品中含有已上市产品中未含有的新杂质，则建议首先通过改进处方工艺降低杂质含量或种类，使不高于被仿制药。 否则需要分析杂质的安全性并提供有关数据，必要时应进行相关的安全性试验。如果国家标准中未规定杂质检查或限度，研制产品的杂质含量不能明显高于已上市的同品种的杂质实测值，杂质种类也不得更多，否则也需要分析杂质的安全性并提供有关数据，必要时应进行相关的安全性试验。 3、检测方法的对比研究（与方法学验证同时进行）： 如研究发现国家药品标准中一些检测方法不适用于研制产品，为进一步验证是检测方法存在问题，还是研制产品自身存在质量问题，可以采用被仿制药进行对比研究。 质量标准的制定（结合对比研究结果、稳定性研究结果制定）： 1）可在国家药品标准的基础上，参考国外药典及参考文献，增加必要的检测项目。 2）检测方法：如新建方法与国家药品标准中收载方法相比无明显优点时，因国家药品标准已经过较长时间和多家单位的验证，建议仍采用国家药品标准中收载方法。 3）限度：有多种方法可参考时，限度的制定遵循“就高不就低”的原则。 4）分别制定货架期标准及放行标准，即注册标准和内控标准，写入申报资料。