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本期关于如何使用NMR/ECD解析内生真菌沉默基因簇的新型天然产物结构
真菌一直是活性天然产物和临床药物的重要来源。真菌基因组中蕴含天然的生物合成基因簇，但这些基因簇在实验室条件下绝大部分是沉默的。基因组测序和生物信息学的进展表明，具有许多生物合成基因簇的真菌相较于标准实验室培养条件下的真菌更具编码次生代谢物的能力。这些未知的沉默基因簇代表着大量未开发的活性天然产物资源。因此，各种基因组挖掘技术不断被开发出来，用于从沉默基因中寻找药源分子。这已成为近年来天然药物化学研究的热点之一。
中国医学科学院药物研究所科研团队应用表观遗传调控、转录因子过表达、异源表达等方法激活真菌中的沉默基因簇，发现常规条件下难以产生的基因组导向的沉默活性天然产物及其形成机制，拓展了活性天然产物的新资源。
植物内生真菌（P. dangeardii）是从有毒植物菜豆（Lysidice rhodostegia）中分离得到的一种丝状真菌。研究人员通过前期实验从P. dangeardii 基因组中鉴定了43个天然产物生物合成基因簇。在实验室条件下，该真菌主要合成酸酐类化合物Rubratoxins，绝大部分基因簇处于沉默状态。为了激活沉默基因，研究人员开发出一种代谢分流的策略，敲除了P. dangeardii 中参与 Rubratoxins 合成的聚酮合酶基因rbtJ，并从所得的突变株中分离鉴定了23个结构新颖且复杂的化合物，其中有三种氮杂环酮聚合物是首次发现，包括亚甲基桥联氮杂环二聚体（Methylene-Bridged Azaphilone Dimer）、螺环多环氮杂环酮二聚体（Spiro-Polycyclic Azaphilone Dimer）和氮杂环三聚体（Azaphilone Trimer），它们同时具有亚甲基和多环桥杂环和螺环结构。研究人员在殷赋云平台（https://cloud.yinfotek.com/）上运用ECD/NMR计算方案对新骨架化合物的复杂结构进行了充分验证。
下文针对本研究中发现的螺环多环氮杂环酮二聚体（Spiro-Polycyclic Azaphilone Dimer，化合物27、28）的ECD/NMR计算方案展开介绍。
ECD操作简述
1. 在PM6和HF/6-31G(D)理论水平上对构象进行了优化。
2. 根据玻尔兹曼分布理论计算了室温平衡构象群（Room-Temperature Equilibrium Populations），并保留了值大于1%的主要构象。
3. 在B3LYP/631G(D)理论水平下对所选构象进行了优化并运用振动频率分析证实结构的稳定性。
4. 采用IEFPCM模型、TD-DFT方法在甲醇溶液中进行ECD计算，计算了100个激发态的旋转强度（rotatory strength）。
5. 在殷赋云平台上，运用ECD/UV分析工具重叠每个跃迁的高斯函数模拟ECD光谱。
研究人员通过NOESY相关（NOESY correlation）分析确定了化合物27的相对构型。轴向H-11΄a与H-1/H-10以及H-10与H-9/H-10΄/H-11΄a的NOESY相关信号表明，这些质子位于四氢吡喃环的同一侧，而H-9΄a与H-11΄b的相关信号表明这些质子位于另一边（图1）。
根据氮杂环丙酮单体相同的生物合成途径， C-7和C-7΄的绝对构型被指认为R。由图2可见，构型(3R,9R,10S,10'R,7R,7'R)-27在200-250 nm之间、300 nm附近有正科顿效应，在340 nm附近有负科顿效应，与实验ECD图谱非常吻合，而差向异构体(3S,9S,10R,10'S,7R,7'R)-27的计算图谱与实验图谱有明显差异（编者按：化合物27的差向异构体在下文中确证为化合物28）。因此，化合物27的绝对构型确定为(3R,9R,10S,10'R,7R,7'R)，命名为Didangelone F。
根据HRESIMS和13C NMR，化合物28的分子式被推测为C42H34O17。一维和二维NMR分析表明，化合物28的平面结构与27相同。两者在C-3/C-9/C-10/C-10΄的立体化学（Stereochemistry）上不同，相对构型相同（图1）。化合物28的CD曲线与(3S,9S,10R,10'S,7R,7'R)-28的ECD计算值相符。因此，化合物28的绝对构型为(3S,9S,10R,10'S,7R,7'R)-28，它实际上是化合物27的非对映异构体，命名为Didangelone G。
在本项研究中，研究人员采用代谢分流和OSMAC策略相结合的方法，成功地激活了内生真菌P. dangeardii 中的沉默基因簇，发现了许多具有不同结构和生物活性的新天然化合物。针对新化合物中首次发现的亚甲基桥联和多环氮杂环二聚体和三聚体，研究者运用NMR/ECD计算方法对新骨架化合物的复杂结构进行了充分验证，为深入了解此类化合物的生物合成机理提供了理论基础。该研究成果已经发表在《药学学报》英文刊（Acta Pharmaceutica Sinica B）上。
